真实时间荧光PCR技术简介

真实时间荧光聚合酶链反应（qPCR），又称为量子PCR，是一种基于聚合酶链反应的实验技术。它通过使用荧光探针来监测DNA模板与引物之间的复制过程，从而实现对目标序列浓度的快速、精确和高通量检测。

qPCR仪器概述

qPCR仪是执行这个实验过程中不可或缺的一部分，它包含了温度控制单元、泵系统和检测系统。现代qPCR仪通常配备有多孔板位，允许用户同时进行多个样本分析。此外，许多现代PCRTerminal还支持自动程序设计和数据分析功能，这极大地提高了工作效率。

qPCR原理

在每一次循环中,qPCR会将模板DNA加热至高温，使得双股DNA解裂成单股；随后降低温度使其结合特定的引物形成新的双股结构。然后，在下一个循环中，这些新生成的双股作为模板再次参与复制。这一过程被重复进行直到达到所需数量时才停止。

qPCR中的探针类型

1. 定性探针：

定性探针是一种在每次扩增周期末尾都可以脱离并被检测到的探针。这种探针常用于初步筛查目的，即确定某个基因是否存在于样本中。

2. 定量探针：

定量探针则需要在特定的扩增温度上绑定，并且其亮度与目标序列的副本数成正比，因此可用于准确计算特定基因片段在样品中的拷贝数。

3. 相对定量（RQ）模式：

相对定量模式是利用内参作为参考点，与之比较目标基因表达水平变化。在这个模式下，内参保持不变，而待测基因可能会出现显著变化，因此适用于研究某一条件下的相对表达差异。

4. absolute quantitation：

绝对定量则直接提供实际副本数，无需参照任何内参。这通常涉及到标准曲线法，即使用已知副本数的标准品来构建曲线，然后根据测试样品所获得信号强度估算出具体副本数值。

实验操作流程总结

准备好所有必要的试剂和设备：包括但不限于模板DNA、引物、大师混合液以及特殊染色剂。

设置好PCRTerminal：选择适当程序，如两步式或热启动/冷终止等，以及预设好的参数如延伸时间等。

运行实验：按照预设程序逐步增加温度，最终达到融化点以释放所有模板DNA。

数据分析：通过软件工具处理原始数据，获取最终结果，比如插入阈值以上累积分子计数等指标。

验证结果：通过质控材料进行校正，以确保结果准确无误。

应用领域概述

qPCR广泛应用于各种生物学研究领域，如遗传学、病毒学、微生物学以及癌症诊断等。在这些领域中，它能够提供关于特征区域拷贝数量或表达水平的小范围信息，这对于理解疾病机制至关重要，同时也为临床治疗提供了依据。不过，由于成本较高，对操作技能要求较高，所以仅限于专业实验室环境使用。